Manuel d'instructions du kit de PCR en temps réel de génotypage HPV PRAXISDIENST

PRAXISDIENST HPV Genotyping PCR en temps réel

Kit de PCR en temps réel de génotypage HPV
Mode d'emploi
Date d'entrée en vigueur : 10 janvier 2022
Pour usage professionnel seulement.
Pour usage diagnostique in vitro uniquement.

UTILISATION PRÉVUE

HPV Genotyping Real-Time PCR Kit est un test de diagnostic in vitro pour la détection qualitative de l'acide nucléique du virus du papillome humain (VPH) de type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53 , 56, 58, 59, 66 et 68 dans des échantillons d'écouvillon cervical. Le kit peut également être utilisé pour la détection mais pas pour la différenciation entre les HPV de type 26, 73 et 82.
Le kit HPV Genotyping Real-Time PCR identifie uniquement les types HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 26, 73 et 82, il ne peut pas être utilisé pour la détection des autres types de VPH. Le kit est utilisé pour le diagnostic d'identification auxiliaire et la surveillance épidémiologique de HPV-6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 26 , 73 et 82 infections, ne peuvent servir de base au diagnostic ou à l'exclusion des seuls cas.
Pour usage professionnel seulement.
Pour usage diagnostique in vitro uniquement.

PRINCIPE

HPV Genotyping Real-time PCR Kit est un test de diagnostic qualitatif in vitro pour la détection de la séquence d'acide nucléique HPV de type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56 , 58, 59, 66, 68, 26, 73 et 82 à partir de spécimens. La séquence L1 conservatrice du cadre de lecture tardif (environ 1500 pb) du papillomavirus humain (HPV) est sélectionnée comme cible de détection. Selon les caractéristiques des séquences d'acides nucléiques de chaque type, des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes sont conçues pour couvrir les types cibles de génomes de HPV. De plus, le gène de la β-globine du génome humain est introduit dans le processus en tant que paramètre interne non compétitif pour surveiller l'ensemble du processus d'extraction et de détection. Ce kit peut être utilisé pour le diagnostic auxiliaire de l'infection par le génotype HPV en clinique.

COMPOSANTS

Composantes		BSJ01M1	Les ingrédients principaux
Taille du kit		48 tests/trousse
Ampréactif de lification	Solution de réaction PCR	960μL×2	Appuyez sur ADN polymérase, dNTP, tampon PCR, etc.
	Solution de détection #1	240μL×1	Amorces et sondes pour HPV 6, 11, 31, 59 et référence interne

	Détection Solution # 2	240μL×1	Amorces et sondes pour HPV 16, 18, 35, 51 et 45
	Détection Solution # 3	240μL×1	Amorces et sondes de HPV 33, 58, 52, 68 et 39
	Détection Solution # 4	240μL×1	Amorces et sondes de HPV 53, 56, 26, 73, 82 et 66
Le contrôle	Positif Contrôle	240µL×1	Plasmides recombinants de HPV 31, 16, 39 et 53
	Négatif Contrôle	240µL×1	Solution contenant interne plasmide de gène de référence

• Le contrôle positif et le contrôle négatif doivent être réglés pour surveiller le corps du test et l'environnement d'exploitation ; le contrôle négatif et positif ont été conditionnés dans le kit.
• Les composants de différents lots ne peuvent pas être mélangés pour être utilisés.
• Équipement ou matériel requis mais non fourni : kits de prélèvement d'échantillons, kits d'extraction d'acide nucléique ; Tubes et bouchons PCR, etc. pipette et pointes de pipette, vortex, etc.

INSTRUMENT APPLIQUÉ
Le kit peut être appliqué au système de détection PCR quantitatif fluorescent de Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd., Line-Gene 9600 Plus (FQD-96A). L'instrument doit contenir au moins cinq canaux FAM, HEX, ROX, CY5 et ​​Cy5.5.

AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS

• Pour usage professionnel en diagnostic in vitro (IVD). Ne pas utiliser après la date de péremption.
• Lisez attentivement la notice avant d'effectuer le test. Les opérations appropriées à partir de la collecte, du stockage et du transport des échantillons, et des tests de laboratoire doivent être strictement manipulées conformément aux réglementations pertinentes en matière de biosécurité et de gestion des laboratoires moléculaires.
• Suivez les précautions standard. Tous les échantillons de patients et les contrôles positifs doivent être considérés comme potentiellement infectieux et manipulés en conséquence.
• Ne pas pipeter à la bouche. Ne pas manger, boire, fumer, appliquer des cosmétiques ou manipuler des lentilles de contact dans les zones où des réactifs et des échantillons humains sont manipulés. Se laver soigneusement les mains après avoir manipulé les échantillons et les réactifs du kit.
• Tous les articles de chaque quartier sont à usage spécial et ne peuvent être échangés pour éviter la pollution. L'établi doit être nettoyé immédiatement après la fin de chaque expérience.
• Utiliser des gants jetables sans substances fluorescentes, des tubes à centrifuger spéciaux jetables, etc. Éviter la contamination du réactif par l'ADN.
• Utilisez un équipement de protection individuelle tel que (mais sans s'y limiter) des gants, une protection oculaire et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit, lors de l'exécution de ce test et de la manipulation des matériaux, y compris sampréactifs, pipettes et autres équipements et réactifs.
• Le résultat du test faussement positif ou négatif peut être dû à une mauvaise qualité de l'échantillon, à des opérations incorrectes en sampla collecte, le transport ou le traitement en laboratoire, ou la limitation de la technologie. L'opérateur doit bien comprendre les principes des procédures et ses limites de performance à l'avance et éviter intentionnellement toute erreur potentielle
• Amples technologies de lification telles que la PCR sont sensibles à l'introduction accidentelle de produits de PCR ampréactions de lification. Des résultats incorrects peuvent se produire si l'échantillon clinique ou les réactifs en temps réel utilisés dans le ampl'étape de lification sont contaminés par l'introduction accidentelle de ampproduit de lification.
• Des zones de laboratoire séparées sont recommandées pour effectuer les procédures prédéfinies du test. Zone Ⅰ : Zone de préparation des réactifs - réactif nécessaire à la préparation amplification. Zone Ⅱ : Sample traitement zone-traitement des s testésampfichiers et contrôles. Zone Ⅲ : région de détection PCR-PCR ampdétection de lification.
• La séparation de la solution réactionnelle doit éviter autant que possible la génération de bulles d'air. Avant le amplification, veillez à vérifier si les bouchons de chaque tube de réaction sont bien serrés pour éviter de contaminer l'instrument.
• Samples s doivent être complètement mis dans la solution de réaction lors de l'ajout de samples. Nonampdoivent adhérer à la paroi du tube et le bouchon doit être serré dès que possible après l'ajout de samples.
• L'acide nucléique extrait sample doit être utilisé immédiatement après l'extraction.
• Après amplification, veuillez retirer immédiatement le tube de réaction, le sceller dans le sac en plastique spécial, le mettre à l'endroit désigné et attendre le traitement unifié.
• Éliminer les réactifs du kit utilisés/inutilisés et les échantillons humains conformément aux réglementations locales, nationales et fédérales.

CONSERVATION ET DUREE DE VALIDITE

• Le kit doit être stocké à -25C ~ -15C à l'abri de la lumière et éviter les gels-dégels répétés. Le kit se conserve 3 jours à 2-8 C après ouverture.
• Le kit peut être stocké jusqu'à 12 mois si tous les composants sont conservés de la manière ci-dessus. Ne pas utiliser après la date de péremption indiquée.
• Le kit peut être transporté dans une boîte en mousse scellée avec des sacs de glace ou de la neige carbonique à une température ne dépassant pas 8 ° C pendant 5 jours maximum.

PRÉLÈVEMENT, STOCKAGE ET TRANSPORT DES ÉCHANTILLONS

• Spécimen : Spécimens cervicaux sur écouvillon
• Prélèvement : Les échantillons cervicaux peuvent être prélevés par des méthodes conventionnelles avec un écouvillon cervical stérile jetable. Insérez la pointe de l'écouvillon cervical dansample liquide conservateur et secouez pour libérer le spécimen cervical.
• Stockage : Il est recommandé de traiter les échantillons dès que possible après le prélèvement. Si les échantillons ne sont pas traités immédiatement, ils doivent être conservés à
  2- 8 C pendant 3 jours maximum. Si un retard de traitement est prévu, les échantillons doivent être conservés à -20 °C ou moins pendant 3 mois maximum. Les échantillons ne doivent pas être congelés et décongelés fréquemment.
• Transport : L'échantillon doit être transporté avec 0C curlune bouteille ou une boîte en mousse scellée avec de la glace jusqu'à 5 jours.

PRÉTRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS (ZONE D'ÉLIMINATION DES ÉCHANTILLONS)
Suivez les instructions du kit d'extraction et de purification des acides nucléiques.
Il est recommandé d'utiliser MagaBio plus Virus DNA/RNA Purification Kit (BSC57 ou BSC71) pour purifier l'acide nucléique. Il est recommandé d'utiliser l'extracteur d'acide nucléique Gene Pure Series pour extraire automatiquement l'acide nucléique.

Remarque : Le contrôle négatif, le contrôle positif et l'échantillon inconnu doivent être testés dans la même expérience.
Il est recommandé de préparer le réactif avant le prétraitement de l'échantillon pour s'assurer que les réactifs ne sont pas contaminés.

UTILISATION DU KIT – RÉACTION PCR (ZONE DE TEST PCR)

Le réactif se prépare
Décongeler les réactifs à température ambiante. Mélanger délicatement et centrifuger tous les réactifs pendant quelques secondes.
Préparez les réactifs PCR en fonction de la quantité d'échantillons et de contrôles comme ci-dessous (N signifie le nombre d'échantillons et de contrôles. Un contrôle à blanc supplémentaire est fortement recommandé pour éviter la perte du mélange réactionnel.) :

Remarque:

• En raison de la viscosité élevée du liquide de réaction PCR, il convient de prêter attention au résidu du pipetage. Il est fortement recommandé d'augmenter la quantité de formulation de manière appropriée, lorsque le nombre d'échantillons est élevé.
• Pour chaque ensemble d'expériences, un contrôle positif supplémentaire à blanc et un contrôle négatif supplémentaire à blanc doivent être introduits.
  Distribuer 15 μL de réactifs PCR mixtes (dans le flacon n° 1, le flacon n° 2, le flacon n° 3 et le flacon n° 4) dans chaque tube PCR, puis transférer la plaque de réaction sur sampla zone de traitement.

Ajout de sample
Considérez que chacun des quatre tubes PCR contient le réactif du flacon n° 1, du flacon n° 2, du flacon n° 3 et du flacon n° 4 respectivement en tant qu'équipe de test pour un seul échantillon ou un contrôle.
Ajouter 5μL de contrôle négatif, 5μL de produit extrait (dans chaque tube PCR d'une équipe de tubes à essai), 5μL de contrôle positif dans différents tubes PCR. Boucher les tubes PCR immédiatement pour éviter la contamination croisée.
Remarque : Ne pas apposer d'étiquette sur la zone scannée des tubes de réaction !

réaction PCR
Placer les tubes de réaction sur un instrument PCR.
Il est recommandé de choisir les canaux FAM, HEX, ROX, CY5 et ​​Cy5.5 pour collecter les signaux fluorescents. La valeur de gain du canal FAM doit être réglée sur 10 ; la valeur de gain du canal HEX doit être réglée sur 8 ; la valeur de gain du canal ROX doit être réglée sur 10 ; la valeur de gain du canal Cy5 doit être réglée sur 12 ; la valeur de gain du canal Cy5.5 doit être définie sur 12. Les lignes de base et la ligne de valeur de seuil doivent être définies sur automatique. Réglez la détection des signaux fluorescents à 60C, le volume de liquide est de 20μL. Définir la procédure de réaction comme ci-dessous :

étape	Température	Durée	Nombre de cycles
1	95 ° C	3 min	1
3	95 ° C	10 secondes	40
	60 ° C	15 secondes

NORMES DE CONTRÔLE QUALITÉ
Les performances attendues des contrôles sont les suivantes :

		FAM	HEX	ROX	Cy5	Cy5.5
					Standard
	Ampoule	Aucun	Aucun	Aucun	'S'	Aucun
Nega	#1	détecté	détecté	détecté	amplificati en courbe	détecté
tive	Ampoule	Aucun	Aucun	Aucun	Aucun	Aucun
contrôler	#2	détecté	détecté	détecté	détecté	détecté
	Flacon #3	Aucun détecté	Aucun détecté	Aucun détecté	Aucun détecté	Aucun détecté
	Ampoule	Aucun	Aucun	Aucun	Aucun	Aucun
	#4	détecté	détecté	détecté	détecté	détecté
	Ampoule	Aucun	Aucun	Valeur Ct	Valeur Ct	Aucun
	#1	détecté	détecté	≤ 30	≤ 30	détecté
Postuler	Ampoule	Aucun	Valeur Ct	Aucun	Aucun	Aucun
ive	#2	détecté	≤ 30	détecté	détecté	détecté
contr	Ampoule	Aucun	Aucun	Aucun	Aucun	Valeur Ct
ol	#3	détecté	détecté	détecté	détecté	≤ 30
	Ampoule	Valeur Ct	Aucun	Aucun	Aucun	Aucun
	#4	≤ 30	détecté	détecté	détecté	détecté
Spéci	Ampoule				Valeur Ct

ANALYSE DES RÉSULTATS ET JUGEMENTS
Les performances attendues des spécimens sont les suivantes :

Ampoule	Sous-type de VPH	Canal de détection	Référence Valeur
Flacon #1	6	FAM	39.5
	11	HEX	38.8
	31	ROX	39.1
	Référence interne Les gènes	Cy5	38.2
	59	Cy5.5	38.6
Flacon #2	18	FAM	35.4
	16	HEX	34.5
	35	ROX	36.9
	45	Cy5	39.3
	51	Cy5.5	38.1
Flacon #3	33	FAM	37.1
	58	HEX	35.3
	52	ROX	35.2
	68	Cy5	35.4
	39	Cy5.5	35.5
Flacon #4	53	FAM	38.4
	56	HEX	34.3
	26, 73 et 82	ROX	38.3
	66	Cy5	34.6

Remarque : 

1. Toutes les exigences listées dans la norme de contrôle qualité doivent être respectées, puis les résultats peuvent être interprétés et analysés.
2.  Il peut être considéré comme positif pour un sous-type de VPH spécifique qu'un « S » standard ampla courbe de lification est détectée avec la valeur Ct pas plus que la liste de valeurs de référence ci-dessus pour un canal spécifique dans un flacon spécifique.
3. Il est recommandé de retester qu'un 'S' standard ampLa courbe de lification est détectée avec la valeur Ct supérieure à la liste de valeurs de référence ci-dessus pour un canal spécifique dans un flacon spécifique. Il peut être considéré comme positif pour un sous-type de VPH spécifique si le résultat du nouveau test est cohérent avec le résultat précédent. Sinon, il peut être considéré comme négatif pour un sous-type de VPH spécifique.
4. Il doit être considéré comme négatif pour un sous-type de VPH spécifique qu'aucun « S » standard ampcourbe de lification est détectée.
5. Instructions spéciales : il doit être considéré comme positif de type à risque moyen qu'un 'S' standard ampLa courbe de lification est détectée avec une valeur Ct inférieure à 38.3 pour le canal ROX dans le flacon n° 4. Cela signifie qu'au moins un type parmi 26, 73 et 83 est positif.

LIMITATIONS

1. Testez uniquement le type d'échantillon indiqué. HPV Genotyping Real-time PCR Kit est un acide nucléique in vitro amptest de lification pour la détection qualitative des papillomavirus humains (HPV) de type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66 et 68 ; le kit peut être utilisé pour la détection mais pas pour la différenciation HPV type 26, 73 et 82. Le kit ne détecte pas les sous-types HPV qui ne sont pas mentionnés ci-dessus.
2. L'utilisation du produit doit être limitée au personnel formé aux techniques de PCR et à l'utilisation de l'instrument applicable.
3. Les résultats du test sont juste pour référence clinique. Le test ne doit pas être utilisé comme seul critère de diagnostic. Les résultats doivent être considérés conjointement avec les informations cliniques et autres données à la disposition du médecin.
4. En raison de la limitation du seuil de détection et de la plage de détection, les résultats négatifs n'excluent pas une infection par le VPH et ne doivent pas être la seule base d'une prise en charge des patients. Des tests/analyses de suivi doivent être effectués.
5. Un résultat faux négatif ou faux positif peut se produire par une opération incorrecte en sample ramassage, le transport, le traitement, la pollution par les aérosols ou les erreurs d'exploitation.

DES INDICATEURS DE PERFORMANCE

La validation des performances a été réalisée avec le système de détection quantitatif fluorescent, Line-Gene 9600 Plus (FQD-96A) de Bioer.

• Sensibilité analytique : 20 témoins positifs HPV standardisés par la norme nationale qui contiennent tous les sous-types de détection du kit ont été testés. Le taux de coïncidence positive était de 100 %.
• Spécificité analytique : Aucune réactivité croisée n'a été observée pour les sous-types de HPV et la liste d'échantillons ci-dessous :
  Sous-types de VPH 42, 43, 54, 61, 72 et 81 (à la concentration de 106 à 107 copies/mL).
  Spécimens : virus de l'herpès simplex de type II, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, gonocoque, Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis
  Substances interférentes : sang, glaire cervicale, lubrifiant humain, lavage vaginal, nitrate de miconazole, acétate de phénylmercure
• Précision : Les contrôles positifs et les contrôles faiblement positifs ont été testés par 3 lots de kits avec 10 réplicats par 2 opérateurs pendant 20 jours. Les résultats ont montré que le coefficient de variation (CV) intra-lot, inter-lots, inter-opérateurs et inter-jours était inférieur à 5 %.

Références

1. Schlecht NF, Trevisan A, Duarte-Franco E, et al. La charge virale comme facteur prédictif du risque de néoplasie cervicale intraépithéliale [J]. Int J Cancer, 2003,103(4):519-524.
2. Moberg M, Gustavsson I, Glyllensten U. Système basé sur la PCR en temps réel pour la quantification simultanée des types de papillomavirus humains associés à un risque élevé de cancer du col de l'utérus [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(7):3221-3228

SYMBOLE DESCRIPTION

	Fabricants		Numéro de catalogue
	marque CE		Représentant autorisé dans la communauté européenne
IVT	Code du lot		Consulter les instructions d'utilisation
LOT	Dispositif médical de diagnostic in vitro		Limitation de température
	Attention		Utiliser par date
	Contrôle positif		Contrôle négatif

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Documents / Ressources

PRAXISDIENST HPV Genotyping PCR en temps réel [pdf] Mode d'emploi Kit de PCR en temps réel de génotypage HPV, BSJ01M1

Références

• 杭州博日科技股份有限公司
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